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La gestione del campione per esami diagnostici nei pet birds

La gestione del campione per esami diagnostici nei pet birds

Pubblicato il: 24 dicembre 2015 Ultimo aggiornamento: 13 febbraio 2018
Questo articolo ripropone alcuni approfondimenti recentemente pubblicati nella rubrica “Uccelli ornamentali” di IZSVe Pets, il portale dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie dedicato alla medicina veterinaria degli animali da compagnia e rivolto ai medici veterinari liberi professionisti. L’articolo riassume una serie di 3 post in cui vengono fornite alcune indicazioni sulle corrette modalità di prelievo, gestione e conferimento del campione per esami diagnostici negli uccelli ornamentali.

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Tra le cause principali di un’errata diagnosi di laboratorio, o meglio dell’impossibilità di confermare con specifici esami il sospetto diagnostico (la cosiddetta “quota residua di errore analitico”), ci sono numerose variabili pre-analitiche.

Le metodiche d’indagine e le tecnologie correlate hanno raggiunto un notevolissimo livello di affidabilità, che può essere compromesso se a queste non si affianca altrettanta accuratezza nelle procedure di raccolta, selezione, trasporto e conservazione del campione.

Di seguito sono presentate alcune indicazioni sulle modalità di prelievo, conservazione e consegna di campioni per i principali esami diagnostici che riguardano gli uccelli ornamentali.

Avere le idee chiare

gestione del campione per esami diagnostici nei pet birds

Prima di inviare i campioni in un laboratorio il veterinario clinico che formula il sospetto diagnostico deve avere chiaro: che tipo di esame richiede, quali agenti eziologici sospetta, che possibilità ha di prelevare e gestire correttamente il campione fino alla consegna, quanto può o vuole spendere.

Prima di inviare i campioni in un laboratorio il veterinario clinico che formula il sospetto diagnostico deve avere chiaro:

1) Che tipo di esame richiede al laboratorio

Per esempio: test immunoenzimatico, biomolecolare, esame batteriologico colturale, isolamento virale, istologico, citologico, etc. La scelta dell’esame deve basarsi sulle informazioni che ogni tipo di esame è in grado di fornire. Dal tipo di esame dipende anche il tipo di campione da prelevare e la modalità con cui prelevarlo, conservarlo e trasportarlo.

2) Quali sono le caratteristiche dell’agente eziologico che si sospetta

Ogni microrganismo ha un suo modo diverso di infettare l’ospite per quanto riguarda la via d’ingresso, gli organi in cui replica, le vie da cui viene eliminato, la modalità con cui viene eliminato, il tempo di persistenza nei differenti organi/apparati.

Varia è anche la resistenza all’ambiente esterno, sia del microrganismo sia dei tessuti in cui replica. Da questo dipende la possibilità di individuare il microrganismo tramite esami di laboratorio che ne richiedono una conservata vitalità o integrità del suo materiale genetico, o che necessitano di un mantenimento della struttura dei tessuti e delle cellule infettate.

3) Che possibilità si hanno di effettuare un corretto campionamento, mantenimento e trasporto del campione

Se non si dispone di idonei terreni di trasporto o non si riesce a far arrivare in campione nei modi e nei tempi idonei per tentare alcuni tipi di esami, occorre dirottare la scelta su altri test meno esigenti.

4) Quanto si può o si vuole spendere

Alcuni esami sono molto costosi, quindi se non strettamente necessari, possono molto spesso essere sostituti da altri più economici ma sufficienti a confermare il sospetto diagnostico.

I campioni per ogni tipo di esame

gestione del campione per esami diagnostici nei pet birds

Per ogni tipo di esame può cambiare il campione da prelevare e la modalità con cui prelevarlo, conservarlo e trasportarlo.

Il tipo di esame da richiedere dipende da alcuni fattori quali: l’agente eziologico sospettato, le metodiche disponibili, la fase dell’infezione, l’eventuale terapia che si è intrapreso, il tipo d’informazione che si vuole ricavare.

Per ogni tipo di esame può cambiare il campione da prelevare e la modalità con cui prelevarlo, conservarlo e trasportarlo.

Esami batteriologici colturali

Nel caso si vogliano richiedere esami batteriologici colturali è preferibile prelevare i campioniprima di intraprendere una terapia antibiotica. Se l’animale è sottoposto a trattamento antimicrobico e non è possibile sospendere la terapia, occorre indicarlo nella richiesta.

Bisogna utilizzare tamponi sterili con specifici terreni di trasporto, che riescono a mantenere vitali i microrganismi e nello steso tempo evitano le crescite batteriche indesiderate.

Fare attenzione ad ogni contaminazione esogena del campione. I terreni di trasporto sono stati creati per proteggere i microrganismi da essicazione, acidi grassi tossici condizioni sfavorevoli di pH, effetti letali dell’ossigeno atmosferico Per la raccolta e conservazione dei campioni batteriologici i più usati sono:

  • Terreno di Stuart
  • Terreno di Amies
  • Terreno Cary-Blair

gestione del campione per esami diagnostici nei pet birds

Tra i batteri più esigenti ci sono campylobacter, i micoplasmi, i micobatteri, le clamidie e i clostridi. Questi microrganismi richiedono temperature, condizioni ambientali e terreni di trasporto specifici

In alcuni studi si sono valutati gli effetti protettivi di vari dispositivi di trasporto fino a 72 ore conservati sia a temperatura ambiente (T.A.) che a 4 °C. I tamponi a secco in generale non mantengono la vitalità dei microorganismi, tamponi con terreno di trasporto consentono la vitalità fino a 24 h a T.A. ma  solo tamponi con terreno di trasposto conservati a 4 °C consentono di ritrovare organismi vitali dopo 48-72 ore.

Tra i batteri più esigenti ci sono campylobacter, i micoplasmi, i micobatteri, le clamidie e i clostridi. Questi microrganismi richiedono temperature, condizioni ambientali e terreni di trasporto specifici.

  • I campylobacter sono molto sensibili agli shock termici, quindi occorre evitare la refrigerazione e il congelamento. Richiedono inoltre terreni particolari quali Amies addizionato con carbone attivo.
  • Le clamidie e i micoplasmi possono essere conservati e viaggiare refrigerati o congelati ma con terreni molto particolari forniti in genere dal laboratorio. Le clamidie inoltre vengono spesso eliminate in modo intermittente, quindi occorre fare più campionamenti e spedirli insieme (almeno tre tamponi cloacali o feci raccolte nell’arco di 5/7 giorni per es.). I tamponi con calcio-alginato potrebbero inibire la crescita delle clamidie, dacron e rayon sono da considerarsi fibre ideali per i batteriologici colturali.
  • I clostridi invece, oltre a richiedere terreni di trasporto particolari (Amies al carbone), sono molto sensibili all’ossigeno, quindi occorre evitare il contatto prolungato con l’aria.

Esami micologici

Per gli esami micologici si preferiscono tamponi a secco a temperatura ambiente,immessi direttamente in una provetta sterile vuota o in terreni selettivi. Il materiale deve essere prelevato durante la fase acuta della malattia, il prelievo si deve effettuare nelle zone sospette di micosi (raccolta di ife).

Nelle micosi superficiali, il prelievo va fatto dalle aree che presentano lesioni caratteristiche, l’animale inoltre non deve aver effettuato alcuna terapia antifungina locale.

Nei soggetti  sottoposti a terapia il prelievo dovrà essere eseguito possibilmente dopo qualche giorno dall’ultimo trattamento.

Esami parassitologici

Per gli esami parassitologici si possono prelevare campioni a temperatura ambiente o refrigerati o, per un’eventuale identificazione di specie, fissati in alcool al 70%.

Esami citologici e ricerca di emoparassiti

Per gli esami citologici e la ricerca di emoparassiti quali Haemoproteus spp., Leucocitozoonspp., Plasmodium spp. si possono allestire preparati da colorare mediante impronta d’organo fresco (preferibilmente da polmone che rappresenta la matrice più idonea) o sangue su vetrino, che possono essere conservati e spediti a temperatura ambiente.

Esami istopatologici

Per le indagini istopatologiche i campioni vanno prelevati il prima possibile dopo la morte per evitare fenomeni autolitici, specie in organi ricchi di enzimi endogeni come il pancreas.

I campioni non vanno mai congelati per non alterare l’architettura dei tessuti, posti in formalina tamponata 10-15%, pezzetti di circa 1 cm3, rapporto di 1/10 minimo a temperatura ambiente (non refrigerare).

Esami virologici

Per gli esami virologici di tipo classico (isolamento in uova embrionate o colture cellulari) occorrono alcune accortezze:

  • effettuare i prelievi nella fase acuta dell’infezione;
  • prelevare organi da animali morti di recente;
  • trasportare il campione nel più breve tempo possibile al laboratorio (entro 24-48 ore) in condizioni di refrigerazione, utilizzando idonei terreni di trasporto (diversi da quelli per batteri!).

I terreni idonei per esami virologici

gestione del campione per esami diagnostici nei pet birds

Alcuni terreni idonei per esami virologici sono: soluzione salina tampone fosfato (PBS); soluzione fisiologica; soluzione saccarosio-fosfato 0,2 M; terreno essenziale minimo di Eagle con siero fetale di vitello al 2%; soluzione salina bilanciata di Hank’s, Leibovitz-Emory medium (LEM), Brain Hearth Infusion (BHI).

Alcuni terreni idonei per esami virologici sono:

  • soluzione salina tampone fosfato (PBS);
  • soluzione fisiologica;
  • soluzione saccarosio-fosfato 0,2 M;
  • terreno essenziale minimo di Eagle con siero fetale di vitello al 2%;
  • soluzione salina bilanciata di Hank’s, Leibovitz-Emory medium (LEM), Brain Hearth Infusion (BHI).

A questi terreni si aggiungono di solito degli antibiotici e antimicotici per inibire la crescita della flora microbica batterica o micotica normale. Si possono aggiungere inoltre sostanze comegelatina, siero, albumina, glicerina per stabilizzare le proteine e proteggere i virus dal congelamento. Importante in ogni caso controllare il pH, che deve essere sempre compreso tra 7,0 e 7,4.

Molti virus fuori dall’ospite sono estremamente labili e sensibili agli insulti ambientali, in particolare i virus con envelope, tipo i virus influenzali (Orthomyxovirus) e gli Herpesvirus che, se congelati a -20 °C perdono di vitalità per distruzione della membrana lipidica. Tamponi contenente dacron, raion o poliestere sono da preferire a quelli composti da solo cotone (tossico per molti virus) o contenenti calcio alginato (tossico per Herpesvirus).

Siti di campionamento e modalità di esecuzione

L’aggiunta di antibiotici nel terreno di trasposto dipende anche dal tipo di campione e dal sito di campionamento. I siti possono essere distinti in siti non sterili, per i quali è necessario l’antibiotico e/o l’antimicotico, e siti sterili. In ogni caso è opportuno far viaggiare sempre i campioni refrigerati (+ 2-8 °C).

gestione del campione per esami diagnostici nei pet birds

Gli esami virologici richiedono alcune accortezze nel prelievo e nella gestione del campione, in particolare legate alla sterilità o meno del sito di campionamento.

Siti non sterili

  • Congiuntiva: strofinare il tampone precedentemente inumidito con il terreno di trasporto quindi immergerlo in provetta sterile con 1 ml di idoneo terreno di trasporto
  • Cute o mucose: aree dove sono presenti le lesioni (lesioni vaiolose o erpetiche per es.), epitelio che le ricopre, raschiati del margine delle lesioni: immettere direttamente le porzioni di tessuto con lesioni in contenitori sterili o idoneo terreno di trasporto;
  • Cavo orale: aree dove sono presenti lesioni (difterovaiolo, lesioni erpetiche), mucosa o pseudomembrane che le ricoprono, raschiati del margine delle lesioni: immettere direttamente le aree di mucosa con lesioni in contenitori sterili o idoneo terreno di trasporto;
  • Lesioni cutanee pustolose (vaiolo): immettere direttamente le aree con lesioni in contenitori sterili o idoneo terreno di trasporto;
  • Naso e trachea: inserire il tampone in una narice (privilegiare quella con scoli limpidi) o in trachea, lasciarlo per qualche secondo in modo che le secrezioni possano essere assorbite, quindi immergerlo in provetta sterile con 1 ml di idoneo terreno di trasporto;
  • Faringe: strisciare il tampone delicatamente per qualche secondo sulla mucosa, quindi immergerlo in provetta sterile con 1 ml di idoneo terreno di trasporto;
  • Cloaca: inserire il tampone per 1-2 cm, ruotarlo più volte e sistemarlo in terreno ricco di antibiotici.
  • Feci: (2-4 grammi) in contenitore pulito.

Siti sterili

  • Materiale autoptico prelevato sterilmente: mettere in contenitore sterile, trasportare refrigerato.
  • Sangue incoagulato (fase acuta e sintomatica) in provette contenenti eparina, EDTA o citrato sodico: portare in laboratorio al più presto.
  • Aspirati (liquido ascitico, liquido sinoviale, articolare): mettere in contenitore sterile.

Costo e convenienza

gestione del campione per esami diagnostici nei pet birds

Oggi sono disponibili metodiche biomolecolari (PCR o RT-PCR) per i principali agenti patogeni degli uccelli d’affezione, che offrono diversi vantaggi, tra cui tempi di esecuzione molto rapidi, elevata sensibilità e modalità di campionamento più facili.

Gli esami colturali sono esami che richiedono una particolarissima attenzione nel campionamento e trasporto e in genere sono molto costosi. Vanno richiesti per una finalità specifica (possibilità di caratterizzazione completa genotipica e fenotipica del microrganismo, produzione di vaccini stabulogeni etc.) o quando non è possibile eseguire altre metodiche diagnostiche.

Oggi sono disponibili metodiche biomolecolari (PCR o RT-PCR) per i principali agenti patogeni degli uccelli d’affezione (Polyomavirus, Circovirus, Herpesvirus, Adenovirus, Toxoplasma, Atoxoplasma, Clamidia, Micobatteri, Clostridi, per es.). Attraverso questi test arrivare a formulare una diagnosi eziologica precisa. I vantaggi delle metodiche biomolecolari sono:

  • tempi di esecuzione molto rapidi;
  • elevata sensibilità (permettono quindi di individuare il microrganismo per più tempo e anche a concentrazioni molto ridotte);
  • modalità di campionamento più facili;
  • non occorre che il microrganismo sia vitale per essere individuato.

Rimane in ogni caso per il veterinario che formula il sospetto diagnostico la necessità di prelevare il campione più idoneo, ossia quello che – in base alle caratteristiche del microrganismo e alla patogenesi della malattia – offre maggiori chance di individuare l’agente patogeno.

Gestione del campione per esami con metodiche biomolecolari

Per questo tipo di esami si possono prelevare tamponi secchi, pezzetti di organo o fluidi organici e trasportarli in contenitori sterili anche a temperatura ambiente, se arrivano in laboratorio nel giro di poche ore dal prelievo.

Molto utilizzate negli ultimi anni sono le FTA card: dei cartoncini in cui, in un punto ben preciso evidenziato del cartoncino stesso, è possibile depositare piccole quantità di campione (sangue, fluidi organici, omogenati e strisci d’organo). Le FTA card contengono composti in grado di lisare le cellule, denaturare le proteine e proteggere gli acidi nucleici dai danni dovuti agli enzimi cellulari, all’ossidazione e all’azione dei raggi ultravioletti.

Inoltre inattivano rapidamente batteri e altri microrganismi (compreso l’agente eziologico cercato) impedendone la crescita. In questo modo è possibile inviare il campione in laboratorio senza rischi di tipo biologico, ma ovviamente non possono essere usate per l’isolamento. Il DNA o l’RNA raccolto sulle FTA card rimane stabile per diversi mesi a temperatura ambiente.

Errori frequenti da evitare

gestione del campione per esami diagnostici nei pet birds

Alcuni errori frequenti nella gestione del campionamento per esami biomolecolari possono generare falsi negativi o falsi positivi.

Anche per gli esami biomolecolari occorre evitare di commettere alcuni errori frequenti che possono essere alla base di un’errata diagnosi, generando falsi negativi o falsi positivi.

Principali motivi di falsi negativi

  • Errata selezione del campione o momento del prelievo
    Come per gli altri esami, nonostante la maggiore sensibilità delle metodiche biomolecolari, sbagliare in fase di campionamento può portare a un esito negativo dell’esame.
  • Acidi nucleici degradati
    Campioni prelevati da animali non morti di recente o conservati/trasportati a temperature elevate, in cui le nucleasi endogene o proteasi esogene (per esempio batteriche) hanno rovinato gli acidi nucleici, possono risultare negativi. È sempre raccomandabile, anche per questi test, trasportare i campioni refrigerati e nel minor tempo possibile.
  • Presenza di inibitori della PCR
    Alcuni organi (per esempio fegato o pancreas) sono ricchi di sostanze che inibiscono la PCR, quindi se è possibile selezionare o abbinare un altro organo in cui può essere presente il microrganismo e trasportare i campioni refrigerati e nel minor tempo possibile. Altri esempi di inibitori della PCR sono l’eparina usata come anticoagulate (se possibile usare l’EDTA o il citrato sodico) ed il calcio-alginato presente in alcuni tamponi .

Principali motivi di falsi positivi con esami biomolecolari

  • Contaminazione del campione
    L’elevata sensibilità di queste metodiche espone facilmente al rischio di contaminazione. È quindi molto importante, specie quando si fanno prelievi in più soggetti contemporaneamente, utilizzare una strumentazione diversa per ogni soggetto e non toccare i differenti contenitori in cui andranno riposti i campioni con guanti o attrezzature potenzialmente contaminate.
  • Presenza di acidi nucleici simili a quello del patogeno cercato
    È possibile avere nel campione del genoma che possa assomigliare in alcuni tratti a quello del patogeno cercato, quindi rischiare di avere delle positività aspecifiche. È fondamentale quindi rivolgersi a laboratori che adottino procedure validate e quindi testate per la specificità.

Il campione per esami al microscopio elettronico

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Il microscopio elettronico (ME) ha il vantaggio di individuare molti virus difficili da isolare con tecniche culturali standard.

La ricerca di agenti virali può essere effettuata anche tramite la microscopia elettronica. A questo proposito, nelle specie d’affezione per le quali sono spesso limitati gli strumenti diagnostici, il microscopio elettronico risulta essere un’ottima tecnica diagnostica in grado di visualizzare direttamente i virus da campioni clinici quali feci, organi, tessuti.

Il microscopio elettronico (ME) ha il vantaggio di individuare molti virus difficili da isolare con tecniche culturali standard (nei passeriformi per esempio Citomegalovirus, Herpesvirus, Reovirus Adenovirus, Poxvirus, Polyomavirus, Papillomavirus e Circovirus), e può permettere di dimostrare la presenza di più virus contemporaneamente (come nel caso di enteriti virali).

Il campione per gli esami al ME può essere costituito da pezzetti di organo target della virosi messi in contenitori puliti e trasportati anche a temperatura ambiente, se arrivano in laboratorio nel giro di poche ore. Attenzione però a selezionare correttamente il campione. Il microscopio elettronico è in grado di visualizzare i virus solo se presenti in quantità elevata, quindi occorre individuare e prelevare le parti di organi dove si presume sia stata maggiore la replicazione virale, ossia aree con lesioni evidenti (aree degenerate, proliferative, emorragiche).

In genere con il microscopio elettronico si hanno buoni risultati nelle infezioni acute causate da virus con spiccato tropismo per gli organi parenchimatosi o per le mucose (epatiti , polmoniti, enteriti, tracheiti, orofaringiti virali). Nel caso di lesioni cutanee o delle mucose di tipo vaioloso o erpetico occorre prelevare direttamente le vescicole o le pustole recenti evitando quelle secche.

La consulenza del laboratorio

gestione del campione per esami diagnostici nei pet birds

È sempre consigliabile che il veterinario clinico prenda contatto con il laboratorio di fiducia prima di effettuare il campionamento.

Le indicazioni presenti in questo articolo hanno una valenza generale.

Data l’importanza che riveste la scelta dell’esame, l’allestimento, la conservazione e il trasporto del campione per effettuare una corretta diagnosi, è sempre consigliabile che il veterinario clinico prenda contatto con il laboratorio di fiducia prima di effettuare il campionamento.

Questo garantisce di non commettere errori che possono compromettere l’esito o l’esecuzione stessa dei test che si vogliono richiedere.

Presso l’IZSVe i laboratori delle diverse strutture (diagnostica, batteriologia, parassitologia, virologia) sono a disposizione per fornire il supporto tecnico richiesto, ed eventualmente il materiale e i terreni più idonei per i vari esami.

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