Identificazione di specie ittiche

Attività e laboratori IZSVe sull’identificazione delle specie ittiche

Il Centro di referenza nazionale per lo studio e la diagnosi delle malattie dei pesci, molluschi e crostacei dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie (IZSVe) si occupa di determinazione delle specie ittiche, impiegando metodi ispettivi e biomolecolari.

Grazie al lavoro di personale altamente specializzato, composto da biologi e biotecnologi, è in grado di far fronte a richieste di identificazione di specie ittiche di provenienza regionale e nazionale. L’attività svolta dal Centro è in particolar modo di supporto a veterinari, vigili sanitari, carabinieri del NAS, ufficiali delle capitanerie di porto, guardie di finanza, chiamati a tutelare il consumatore riguardo la salubrità dei prodotti, ma che sempre più spesso si trovano in difficoltà nel riconoscimento della specie.

In queste pagine è possibile consultare Ittiobase il database delle specie ittiche identificate dall’IZSVe che raccoglie le sequenze genetiche di specie comunemente commercializzate in Italia.

Referente IZSVe per l’identificazione delle specie ittiche

Giuseppe Arcangeli
SCS3 – Ecosistemi
Centro di referenza nazionale per lo studio e la diagnosi delle malattie dei pesci, molluschi e crostacei
Tel: 049 8084281
E-mail: garcangeli@izsvenezie.it
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Ittiobase

Ittiobase è un database in continuo ampliamento che raccoglie varie informazioni riguardanti le specie ittiche di interesse commerciale. Il database risponde alla necessità di avere a disposizione sequenze certe di riferimento per tutti i laboratori che effettuano analisi di identificazione di specie ittiche. Per sequenze certe si intende sequenze derivanti da campioni di pesci interi freschi o congelati, identificati morfologicamente mediante chiavi dicotomiche FAO da personale altamente specializzato. Inoltre, i campioni sono georeferenziati almeno a livello di macroaree FAO.

Per ogni specie presente in Ittiobase sono state analizzate e inserite dieci sequenze derivanti da 10 esemplari diversi, partendo da pesci interi con luogo di pesca georeferenziati e identificati morfologicamente secondo i criteri proposti dai manuali FAO. Per ciascun individuo è possibile trovare la sequenza ottenuta mediante l’amplificazione del gene maggiormente utilizzato a livello internazionale per il barcoding di specie (COI).

Sono state create delle schede tecniche facilmente consultabili e di semplice comprensione in cui sono presenti informazioni di carattere generale come la nomenclatura, le zone di distribuzione, le caratteristiche commerciali e i problemi collegati alla sicurezza alimentare e alle frodi. All’interno del database sono inoltre presenti i tracciati IEF di varie specie di interesse commerciale.

Contribuisci anche tu all’aggiornamento di Ittiobase

Anche laboratori esterni possono contribuire all’implementazione del database. Bastano tre passaggi:

1. Contattare il Centro specialistico ittico dell’IZSVe
   Contatti di riferimento: Federica Tosi, tel. 049 8084103, e-mail: ftosi@izsvenezie.it
   Vi verranno fornite tutte le informazioni necessarie per poter considerare valide le sequenze e i campioni in oggetto.

2. Compilazione del format e invio dei prodotti
   Compilare il format Scheda campionamento specie ittiche – PDF e inviarlo via e-mail al personale di riferimento del Centro specialistico ittico. In contemporanea, verrà organizzato con il Centro il trasporto del campione biologico.

3. Inserimento nel database dei campioni ricevuti
   I campioni inviati saranno presi in consegna dal Centro e, se ritenuti idonei, verranno sottoposti ad analisi. Se gli esiti delle analisi risulteranno concordi con quanto dichiarato nel format, le sequenze verranno inserite in Ittiobase.

Dall’avvenuta consegna dei campioni al Centro devono trascorrere mediamente 15 giorni lavorativi per avere il risultato dell’idoneità dei campioni inviati. Ricevuta l’idoneità, i dati verranno inseriti nel database e il nominativo dell’ente/laboratorio inviante verrà inserito tra i “collaboratori esterni” nella sezione “Contatti” dell’applicazione.

Metodiche di identificazione

Prova di sequenziamento

Il prodotto di amplificazione ottenuto viene quantificato e purificato per poter essere sottoposto alla reazione di sequenziamento. La purificazione si ottiene tramite l’uso del kit commerciale “Illustra ExoSTAR-1” (Fisher Scientific) seguendo le indicazioni del fornitore. Nel caso di prodotti di PCR contenenti bande multiple e aspecifiche, si procede con l’estrazione della banda della lunghezza attesa tramite l’uso del kit “Qiaquick Gel Extraction” (Qiagen) e la sua successiva quantificazione.

L’amplificato purificato viene quindi sottoposto a reazione di sequenziamento utilizzando entrambi i primers di amplificazione, ottenendo così due sequenze complementari (figura del ferogramma). Per la reazione di sequenziamento si utilizza il kit “BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies) in un volume finale di 10 µl contenenti: 1 µl di primer specifico (concentrazione 3.3 µM), 1,5 µl di Sequencing Buffer, 1 µl di TRRM, da 1 a 6,5 µl di DNA (a seconda della quantità dell’amplificato). La mix così ottenuta viene sottoposta ad una reazione di PCR con le seguenti condizioni termiche: 25 cicli di 96°C per 10 secondi, 50°C per 5 secondi e 60°C per 2 minuti.

Il prodotto di amplificazione della reazione di sequenza viene successivamente purificato per la rimozione dei reagenti in eccesso. A seconda del numero di amplificati da sequenziare si utilizzano due diversi kit commerciali: “Illustra AutoSeq G-50 Dye Terminator Removal” (GE-Healthcare) nel caso di un numero limitato di amplificati, “Performaâ DTR Ultra 96-Well Plates kit (Edge Biosystem) nel caso di un numero elevato di amplificati da analizzare.

I campioni così ottenuti vengono caricati nel sequenziatore (ABI Prism 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) per l’elettroforesi capillare. Le sequenze ottenute (figura della sequenza) vengono analizzate con i softwares dedicati Sequencing Analysis 5.2 e SeqScape v2.5 seguendo le specifiche del fornitore.

Esempio di elettroferogramma. I due tracciati sono relativi ai due strand complementari amplificati con i due primers di apmlificazione. In alto si trova la sequenza di riferimento con la quale comparare le sequenze ottenute (sequenza del cytochrome oxidase subunit I (COI) gene).

 

AAGATATTGGCACCCTTTACCTAGTATTTGGTGCCTGAGCAGGAATGGTGGGCACAGCCCTAAGTCTCCTAA
ATCCGTGCAGAACTTAGCCAACCTGGGGCTCTCCTTGGAGACGACCAGATCTATAATGTTATTGTTACTGCA
CATGCCTTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATGCCGATTCTAATTGGAGGGTTTGGAAACTGACTAATTCCTC
TTATGATCGGAGCGCCAGATATGGCATTCCCTCGAATAAACAATATGAGCTTCTGACTACTTCCCCCCTCATT
CCTCCTACTACTAGCCTCCTCCGGAGTTGAAGCCGGGGCGGGGACCGGGTGAACGGTATATCCTCCTCTGTC
AGGAAATCTGGCCCATGCAGGAGCATCAGTTGACCTAACCATTTTTTCACTTCATCTAGCAGGTATTTCCTCT
ATTCTAGGGGCCATTAATTTCATTACCACAATTATTAATATGAAACCACCCGCAATCTCACAATACCAAACGC
CTCTGTTTGTCTGATCCGTTCTTGTTACAGCTGTTCTACTTCTTCTATCGCTGCCTGTGCTAGCTGCCGGAATT
ACAATGCTTCTTACAGATCGAAACCTAAACACCACCTTCTTCGACCCAGCAGGAGGGGGAGACCCAATTCTAT

Esempio di sequenza finale ottenuta dal campione in figura. Dopo analisi BLAST questa sequenza è stata identificata come Clupea harengus cytochrome oxidase subunit I (COI) gene.

Normativa

Nel settore ittico il punto di partenza per la filiera diventa la conoscenza dell’origine del prodotto pescato o allevato che sia. A tal proposito il Regolamento UE 1379/2013  prevede che, in fase di vendita al dettaglio, il prodotto fresco, surgelato, salato ed essiccato, riporti le seguenti informazioni obbligatorie (art.1):

• la denominazione commerciale della specie
• il metodo di produzione: pescato, pescato in acque dolci o allevato
• la zona di cattura, secondo le zone FAO.

Per tutte le altre fasi di commercializzazione (art. 2), oltre ai suddetti punti, deve essere aggiunta la denominazione scientifica della specie interessata (secondo la nomenclatura binomia). Quindi, ad esempio, per una pescheria, che vende il prodotto al dettaglio un branzino dovrà essere così identificato:

• specie: branzino;
• metodo di cattura: pescato;
• origine: mare Mediterraneo (oppure zona FAO n.37).

Invece per un commerciante all’ingrosso l’identificazione dovrà contenere anche la corretta denominazione latina:

• Specie: branzino (Dicentrarchus labrax)
• Metodo di cattura: pescato
• Origine: mare Mediterraneo (oppure zona FAO n.37)

Il Ministero della Marina mercantile, il 15 luglio 1983 ha emanato la prima lista di prodotti ittici con denominazione commerciale obbligatoria, cui sono seguite negli anni altre liste aggiornate, fino all’ultimo decreto, emanato dal MiPAAF nel 2017 (G.U. n. 266 del 14/11/2017). Questo significa che se una specie è prevista nell’elenco deve essere denominata solo ed esclusivamente con quel nome commerciale. Una specie che non figura nell’elenco può essere commercializzata con una denominazione commerciale provvisoria stabilita dall’autorità competente dello Stato membro della UE, previa comunicazione al MiPAAFT da parte dell’Autorità Sanitaria competente per territorio. Un esempio: il Morone saxatilis, specie di acqua dolce di origine nord mericana, era chiamato “branzino striato”, ma da quando è stata inserita nell’elenco ufficiale, è d’obbligo la denominazione “persico-spigola”.

Riferimenti normativi

• Decreto MIPAAF del 27/03/2002 in applicazione dei Regolamenti (CE) n. 104/2000 e n. 2065/2001 (recepisce per l’Italia quanto previsto relativamente all’etichettatura e ai sistemi di controllo per i prodotti ittici), GU n. 84 del 10/04/2002
• Decreto MIPAAF del 25 luglio 2005, Modifiche e integrazioni all’elenco delle denominazioni commerciali dei prodotti ittici, allegato al decreto ministeriale 14 gennaio 2005. G U n. 181 del 5/08/2005
• Decreto MIPAAF del 31/01/2008, denominazione in lingua italiana delle specie ittiche indicate nell’elenco allegato che costituisce parte integrante del presente decreto e che sostituisce l’elenco allegato al decreto ministeriale del 25/07/2005, GU n. 45 del 22 /02/2008
• Decreto MIPAAF del 5/03/2010, integrazione elenco decreto ministeriale del 31/01/2008, GU n. 124 del 29/05/2010
• Decreto MiPAAF del 12/08/2011, Attribuzione della denominazione in lingua italiana di alcune specie ittiche, G.U. n. 208 del 07/09/2011
• Decreto MiPAAF del 22/09/2017, Denominazione in lingua italiana delle specie ittiche di interesse commerciale, G.U. n. 266 del 14/11/2017

News dall’IZSVe sull’identificazione di specie ittiche

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