La disponibilità di metodiche adeguate per la differenziazione molecolare dei ceppi Mycoplasma gallisepticum è fondamentale per comprenderne le dinamiche di diffusione negli allevamenti avicoli, e ottenere quindi le informazioni necessarie per il controllo delle epidemie causate da questa specie di micoplasma. In particolare, l’utilizzo della tipizzazione molecolare mediante Multilocus Sequence Typing permette di diversificare in modo dettagliato i ceppi di M. gallisepticum identificati da campioni avicoli, descrivendone eventuali connessioni e relazioni, e distinguendo quelli derivanti da infezioni sul campo da quelli impiegati nei trattamenti vaccinali.
Mycoplasma gallisepticum è una delle specie di micoplasmi considerate più impattanti per il settore avicolo. In Italia sono autorizzati per il pollo due tipi di vaccino per M. gallisepticum, 6/85 e ts-11, entrambi basati su ceppi vivi attenuati del patogeno. È quindi fondamentale poter contare su tecniche di tipizzazione molecolare del batterio in grado di discriminare tra i ceppi vaccinali e i ceppi che possono diffondersi in seguito a un’epidemia.
A dimostrarlo è una ricerca dell’U.O. Micoplasmi dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie (IZSVe) che ha analizzato i risultati di due tecniche di genotipizzazione disponibili per M. gallisepticum: mgc2-Gene Targeted Sequencing (mgc2-GTS) e Multilocus Sequence Typing (MLST). Entrambe le metodiche sono state testate sugli stessi campioni del germe: 40 isolati provenienti da allevamenti avicoli italiani sia di tipo industriale che rurale, colpiti da micoplasmosi tra il 2010 e il 2019. I ricercatori hanno quindi confrontato i risultati ottenuti, recentemente pubblicati sulla rivista scientifica internazionale Vaccines.
Vaccinazione e tipizzazione di Mycoplasma gallisepticum
Mycoplasma gallisepticum è una delle specie di micoplasmi considerate più impattanti per il settore avicolo: aggredisce l’apparato respiratorio di questi animali, causando infiammazione dei sacchi aerei e contribuendo a determinare il complesso della malattia cronica respiratoria (chronic respiratory diseases, CRD). La patologia sostenuta da questo germe genera perdite economiche rilevanti per l’industria avicola: determina mortalità embrionale, ritardi di crescita, incremento degli scarti alla macellazione e di conseguenza riduzioni nella produzione di carne e uova.
La trasmissione di M. gallisepticum può avvenire sia verticalmente, dal genitore alla progenie attraverso l’uovo, sia orizzontalmente, grazie al contatto diretto tra animali o attraverso l’aria e la polvere. Al fine di contenere la sua diffusione nel settore è quindi fondamentale mantenere gli allevamenti da riproduzione liberi dal patogeno.
L’applicazione di stringenti misure di biosicurezza è il modo migliore per prevenire la diffusione dell’infezione, mentre in alcuni casi e contesti epidemiologici specifici è possibile utilizzare la vaccinazione. I trattamenti con antibiotici sono invece inefficaci, in quanto possono attenuare i sintomi ma non sono adeguati per eradicare la malattia.
Ricercatori dell’IZSVe hanno condotto uno studio in cui sono state confrontate due tecniche di genotipizzazione disponibili per M. gallisepticum: mgc2-Gene Targeted Sequencing (mgc2-GTS) e Multilocus Sequence Typing (MLST). Secondo i risultati ottenuti, la tecnica mgc2-GTS garantisce l’identificazione del ceppo vaccinale 6/85 ma non è esaustiva per i ceppi ts-11; al contrario, la tecnica MLST non solo individua entrambi i ceppi vaccinali, ma riesce anche a essere più dettagliata nel differenziare i ceppi rilevati e nel descrivere le relazioni tra loro.
In Italia sono autorizzati per il pollo due tipi di vaccino per M. gallisepticum, entrambi basati su ceppi vivi attenuati del patogeno: 6/85 e ts-11; il primo tipo è autorizzato solo per le galline ovaiole, mentre il secondo anche per i polli da riproduzione. L’utilizzo di questi vaccini come profilassi preventiva comporta però difficoltà nel diagnosticare l’insorgere della malattia, in quanto le analisi di laboratorio possono non distinguere tra i batteri inoculati per la vaccinazione di un gruppo di animali e quelli che derivano da un’infezione di campo. È quindi fondamentale poter contare su tecniche di tipizzazione molecolare del batterio in grado di discriminare tra i ceppi vaccinali e i ceppi che possono diffondersi in seguito a un’epidemia.
Il confronto tra le tecniche di genotipizzazione mgc2-GTS e MLST
Per questo i ricercatori dell’IZSVe hanno condotto uno studio in cui sono state confrontate due tecniche di genotipizzazione disponibili per M. gallisepticum, mgc2-GTS e MLST:
- la tecnica mgc2-GTS identifica il genotipo del patogeno sulla base della sequenza nucleotidica di geni codificanti proteine superficiali del batterio, nello specifico quella codificante la citoadesina mgc2, ovvero la proteina che contribuisce al meccanismo con cui la cellula del patogeno si lega ai recettori dell’organismo ospite; è una tecnica adottata perché sufficientemente sensibile e facilmente riproducibile, anche se può offrire una differenziazione limitata dei ceppi individuati;
- la tecnica MLST identifica il genotipo in base alla sequenza di un set di geni costitutivi (housekeeping gene) del batterio, attraverso un protocollo standardizzato a livello internazionale e il confronto con i dati presenti in un database condiviso, continuamente alimentato da tutti i laboratori che utilizzano il protocollo.
Secondo i risultati ottenuti dai ricercatori IZSVe, la tecnica mgc2-GTS garantisce l’identificazione del ceppo vaccinale 6/85 ma non è esaustiva per i ceppi ts-11, almeno per i ceppi circolanti sul territorio italiano: pertanto non sempre riesce a discriminare tra positività diagnostiche derivanti dalla vaccinazione e quelle che possono indicare un’infezione sul campo. Al contrario, la tecnica MLST non solo individua entrambi i ceppi vaccinali, ma riesce anche a essere più dettagliata nel differenziare i ceppi rilevati e nel descrivere le relazioni tra loro.
L’analisi delle relazioni tra i genotipi individuati mediante MLST, i loro raggruppamenti e i dati relativi al luogo e al momento in cui i campioni erano stati raccolti ha permesso ai ricercatori di comprendere alcune dinamiche epidemiologiche interessanti, come ad esempio la diffusione di uno specifico genotipo (ST27) da un allevamento alle aree circostanti, oppure la recente introduzione in Italia di nuovi genotipi appartenenti a uno stesso gruppo (CC3).
Infatti, mentre con la tecnica mgc2-GTS i ricercatori hanno potuto individuare nei campioni analizzati 6 genotipi diversi di M. gallisepticum, utilizzando la MLST sono stati individuati ben 23 differenti tipi di sequenza (ST), alcuni dei quali raggruppabili per somiglianza genetica (complessi clonali, CC). Di questi 23 genotipi, 9 erano già stati precedentemente pubblicati mentre 14 sono stati identificati e registrati nel database condiviso per la prima volta.
Dalla genotipizzazione alle informazioni epidemiologiche
L’analisi delle relazioni tra i genotipi individuati mediante MLST, i loro raggruppamenti e i dati relativi al luogo e al momento in cui i campioni erano stati raccolti ha permesso ai ricercatori di comprendere alcune dinamiche epidemiologiche interessanti, come ad esempio:
- la diffusione di uno specifico genotipo (ST27) da un allevamento alle aree circostanti,
- il picco di diffusione di un altro genotipo (ST34) in vari allevamenti nel biennio 2013-2014,
- la recente introduzione in Italia di nuovi genotipi appartenenti a uno stesso gruppo (CC3).
Grazie a risultati della tecnica MLST si è potuto infine osservare come il numero di genotipi diversi abbia raggiunto un picco massimo nel 2013, iniziando a declinare dal 2015. A partire dal 2014 inoltre è diminuito il numero dei focolai e quindi dei micoplasmi isolati (11 nel periodo 2014-2019), mentre è aumentato il numero di genotipi individuati ma non ancora descritti (degli 11 micoplasmi isolati nel periodo, 8 erano nuovi genotipi).
Secondo i ricercatori questi trend possono essere spiegati dal rafforzamento delle misure di biosicurezza attuato negli allevamenti coinvolti nello studio per fronteggiare altre problematiche sanitarie avvenute nello stesso periodo, come le epidemie di influenza aviaria oppure gli episodi di anomalie nei gusci delle uova (eggshell apex abnormalities) causate da altre specie di micoplasmi nel settore avicolo.
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